duplex 对 MRD
到底值不值

一、先纠正提问方向：duplex 是减少分子，不是增加

1.1 两个概念先分开

需要一并澄清的是：ssDNA 建库和 duplex consensus 在工程上互斥。ssDNA 建库提高的是转化率 C（把损伤链、短片段、缺口片段也救回来），但它把一个原始双链分子拆成两条独立入库的链，两条链的配对关系在建库时就丢了，除非专门设计链条码。所以"上单链建库"和"上双链纠错"是两条相反的路。（此段为推断，本轮未做专门文献核查。）

1.2 方向判定

duplex 的定义就要求两条链都活到测序并各自形成家族。任何一条链在末端修复、A-tailing、四次接头连接、杂交捕获、PCR、测序任一环节丢失，这个分子在 duplex 口径下就归零，但在 simplex 口径下仍然可用。

所以：

唯一能说"增加"的语境，是 duplex 内部的横向比较——CODEC、ppmSeq、SaferSeqS 相对常规杂交捕获 duplex 能在同样测序量下多拿到 duplex 分子。那是 duplex 之间的比较，不是 duplex 对 simplex。

二、分子账：duplex 到底损失多少（含分母定义表）

这是全部争议的来源。文献里"duplex recovery / yield / efficiency"至少有五个互不通约的分母，数值相差 45 倍以上。任何不带分母的百分比都不能用。

表 2-1｜duplex 产出率的五个分母（数字全部有出处）

必须记住的一条：同一个 NanoSeq，在分母 ② 下是 50–60%，在分母 ⑤ 下是 5%，差 10 倍。Ultima 宣传的 "ppmSeq 44% vs 常规 5–11%" 是分母 ⑤ 内部的比较，成立；但把 44% 读成"分子利用率是常规 duplex 的 9 倍"是错的。

2.2 结论：你该用哪个数

你们的技术路线是 cfDNA + 杂交捕获 + UMI。这条路线对应分母 ①：

2.3 损失发生在哪一步（逐步骤存活率）

第 ③ 步是 duplex 相对 simplex 的净损失，且 Kennedy 明确指出：一旦发生在建库端，加测序无法补救（SSCS:DCS 比 >14–15 时只能重做文库）。

三、错误账：duplex 的背景优势有多大（simplex 必须算上生信打磨）

你的追问是对的：不能用裸 SSCS 的 1×10⁻⁴ 去比。现代 simplex 流程是"UMI 共识 + 位点特异背景打磨 + 位点黑名单 + CH 过滤"，实测地板是 1.5–3.3×10⁻⁵，不是 10⁻⁴。

表 3-1｜背景错误率阶梯（每条都标分母、是否损伤修复、是否位点黑名单）

表 3-2｜duplex vs simplex 的错误率增益 r_ε：同批 vs 跨研究拼接

结论： - 对裸 SSCS：duplex 优势 13–234 倍。这个数字被厂商反复引用，但它比的是没人再用的老流程。 - 对现代 simplex（UMI + 位点打磨）：同批实测只有 2.7–2.8 倍。 - 理论上限 30–50 倍要同时满足：simplex 端不做打磨、duplex 端做完整损伤修复、剔除 CH 和体细胞位点。跨研究拼接得来，不可作为采购依据。

另一条硬约束（Kurtz 的核心论证）：duplex 只能压制技术性背景，压不住生物学背景。克隆性造血（CHIP，约 20% 个体存在，随年龄升高）产生的真实体细胞突变，单次体内突变事件即可造成，duplex 条码完全无法抑制。所以 duplex 理论错误率 <10⁻⁹，生物样本实测卡在 10⁻⁵–10⁻⁶。

四、决策模型：两个区制与交叉点（含公式与算例表）

4.1 模型

符号与假设（全部显式列出，可替换）：

统一 LoD 公式（本报告推导，非文献原文）：

背景假阳性期望       B = M × ε
LoD(VAF) = [ k + z·√(M·ε) ] / M

• 当 M·ε ≪ 1（分子限区）：LoD ≈ k/M —— 与 ε 无关，duplex 因 M 小而纯亏 r_M 倍。
• 当 M·ε ≫ 1（错误限区）：LoD ≈ z·√(ε/M) —— duplex 净收益 = √(r_ε / r_M)。

区制交界：令两式相等 → M* = k²/(z²·ε) = 1.658/ε

duplex 的净收益判据（本报告推导）：

分子限区： LoD 恶化 r_M 倍            （纯亏）
错误限区： LoD 改善 √(r_ε / r_M) 倍
交叉存在的必要条件： r_ε > r_M

用 Kurtz 的同批实测代入：r_ε = 2.75，r_M = 5.3 → √(2.75/5.3) = 0.72，即反而变差 1.4 倍。这就是同一批 cfDNA 上 duplex 的真实成绩单。

4.2 交叉点解析解

令 a = m_simplex，b = m_duplex：

√N* = 3(a − b) / { 2.33 · [ b·√(a·ε_s) − a·√(b·ε_d) ] }

表 4-1｜LoD 算例（30 ng cfDNA，r_M = 4.5，ε_s = 1×10⁻⁵，ε_d = 3×10⁻⁷）

模型自检：N=16、50–66 ng 投入下模型给出约 40–65 ppm VAF，Signatera 宣称 0.01% VAF = 100 ppm；N=48 给出 28 ppm，RaDaR 宣称 LOD95 = 11 ppm（20 mL 血，投入更高）。量级吻合。

独立文献锚点（强证据）：Newman 2016 在同一体系里报告，iDES-CAPP-Seq 用 30 个突变达到 0.0025%；仅取 duplex 分子可达 0.00025%，但原文明确写"只有在个体化 selector 覆盖 >1,500 个突变时才能实现，原因是双链分子回收率的技术限制"。即：文献自己把交叉点框在 30 与 1,500 之间。我的解析解 N* ≈ 1,032 正落在其中。

表 4-2｜交叉点敏感性分析（N* = duplex 开始反超 simplex 的追踪位点数）

A. 常规杂交捕获 duplex（r_M = 4.5，你们目前的化学）

B. 高回收 duplex 化学（r_M = 2，CODEC/链条码/GeneBits 级）

4.3 从敏感性表读出的三条结论

1. ε_simplex 是最强的杠杆。你的生信打磨每把 ε_simplex 压低一档，交叉点就往右移一个数量级——从 1×10⁻⁵ 打磨到 1×10⁻⁶，常规 duplex 在任何位点数下都不再有优势（因为 r_ε 跌破 r_M）。换句话说：与其上 duplex，不如先把打磨做到位。
2. r_M（建库化学）决定交叉点的量级。同样 ε 组合下，r_M 从 4.5 降到 2，交叉点从 1,032 掉到 59，差 17 倍。duplex 值不值，八成取决于你用什么化学做 duplex，而不是要不要做 duplex。
3. duplex 的收益有硬上限 √(r_ε/r_M)。在最乐观的常规组合下是 2.72 倍，而且要 N > 20,000 才逼近 1.9 倍。这不是一个能改变产品定位的量级。

五、按位点数逐档判断：你的 MRD 该不该上 duplex

对你们产品线的直接结论：世和术宁 Ultra 走的是"固定 2,365 基因大 panel + 30,000× 深度 + 平均监测 >16 个突变"的路线。监测的是 >16 个突变，不是 2,365 个基因位点——决定区制的是前者。这落在第一档，分子限区，上 duplex 会让 LoD 恶化约 2.5 倍。真正能改善 LoD 的是把"平均监测突变数"从 16 提到 100–200（见第七节路径一）。

六、主流 MRD 产品实际怎么选的（对照表）

读表的一条规律：上 duplex 的产品全部落在两端——要么位点数上千（MAESTRO），要么投入量极大（TwinStrand 2,000 ng gDNA、Haystack 3 管血）。没有任何一个 50 位点以下、20–60 ng cfDNA 的产品选择 duplex，除了 Haystack，而 Haystack 用采血量补回了分子数。这与第四节的模型完全一致。

同时必须指出：中国厂商（世和、燃石、泛生子）的公开技术参数密度显著低于美国厂商——cfDNA 投入量、分子回收率、是否 duplex、LoD 的分母定义均未公开。国内唯一有同行评议完整分析验证的是吉因加体系。这本身是竞争维度上的一个信息差。

七、比 duplex 更划算的三条路

把所有降噪路径放在同一把尺子上：每条路径对 (r_M, r_ε, reads) 的作用，以及在两个典型工作点的 LoD 改善倍数。

表 7-1｜同一把尺子（基线：30 ng，r_M=1，ε=1×10⁻⁵）

7.1 路径一：位点数扩张——最便宜、最确定

从 16 提到 200 个追踪位点，LoD 改善 6.15 倍（64.6→10.5 ppm），比 duplex 在任何位点数下的理论上限（2.72 倍）都高一倍多。而且这是分子限区的线性收益（LoD ∝ 1/N），不需要改任何化学。

• 实测支撑：TRACERx 从 200 变异下采样，"追踪超过 50 个突变在低 DNA 投入时显著改善灵敏度"，50 变异 + 20–30 ng → MDAF 中位 0.008%；AlphaLiquid 在 0.01% 混合比下，10/50/150 markers 对应约 40%/70%/90% 灵敏度。
• 硬约束是肿瘤突变负荷：吉因加实测每例可用的高排位变异中位只有 CRC 10 个、乳腺 6 个、肺 7 个。要凑到 200 个必须用 WES 甚至 WGS 建基线（TRACERx 中位 200 个突变、126 个 clonal；AccuScan CRC 中位 5,820）。组织端从固定 panel 换成 WES/WGS，是这条路的真正投资项，也是国内产品与 Signatera Genome/NeXT Personal 的分水岭。
• 成本：reads ∝ N。16→200 是 12.5 倍 reads；但捕获区从 3 kb 扩到 ~40 kb，反而摆脱了"小靶区杂交捕获 on-target 只有 5–10%"的效率陷阱。

7.2 路径二：损伤修复——性价比第一，且不必配 duplex

• 产出零损失：MEDUSA 论文正式报告 duplex 产出中位 1.02 倍（范围 0.33–1.46，P=0.258，无显著差异）；Duplex-Repair 报告"与传统 ER/AT 相当的文库转化率与 duplex 产出"。
• ε 降 2.5–4.0 倍：健康 cfDNA 5.8×10⁻⁷→3.0×10⁻⁷（2.5 倍）；癌症患者 cfDNA 1.4×10⁻⁶→4.3×10⁻⁷（4.0 倍）；FFPE 2.8×10⁻⁵→1.0×10⁻⁵（4.0 倍，组织端建基线时最有价值）。
• 对 simplex 同样有效：Duplex-Repair 论文明确指出单链共识水平也有类似的误差抑制。这一点被行业普遍忽略——损伤修复不是 duplex 的配件，它是独立的降噪路径。
• 机制：常规建库中，健康 cfDNA 有 7–9%、癌症 cfDNA 有 15–17%、FFPE 有 32–57% 的"内部碱基对"（距片段两端 >12 bp）是体外重新合成的，会把单链损伤复制成"双链一致"的假阳性。再合成比例与错误率相关 r=0.859。
• 战术含义：如果你已经在做 duplex 却没做损伤修复，你的 duplex 有效性被削掉了 2.5–4 倍——这正是 Kurtz 测到 duplex 只有 1.2×10⁻⁵（而非 3×10⁻⁷）的原因。先补酶，再谈是否 duplex。

7.3 路径三：相位变异（PhasED-Seq）——绕开 duplex 的分子税

• 不损失分子：间距 <20 bp 的相位变异，其覆盖深度"几乎等于样本总深度"；48% 的 PV 长度 <80 bp。r_M ≈ 1。
• ε 极低：doublet PV 8.0×10⁻⁷、triplet PV 3.4×10⁻⁸；商用 CLARITY 报 1.95×10⁻⁸/informative molecule。
• 机制上优于 duplex：技术性 PCR 错误对 PhasED-Seq 和 duplex 都需要两次事件；但生物学背景（CH）只需一次体内突变事件，duplex 完全压不住，而相位变异要求同一细胞在 <170 bp 内发生两次独立突变。这是 duplex 无法弥补的结构性劣势。
• 代价与约束：DLBCL 中位 2,461 个 PV/例，实体瘤中位只有 118 个（范围 14–622）。用我的模型：实体瘤 118 个 PV + 120 ng（GE=36,360，m≈19,600）→ M=2.3×10⁶ → LoD ≈ 3/M = 1.3 ppm，全靠 120 ng 大投入撑着。PhasED-Seq 在血液肿瘤是压倒性的，在实体瘤要靠加血量。加上 Stanford/Foresight 的专利壁垒。

7.4 如果一定要上 duplex：唯一正确的做法

不要上常规杂交捕获 duplex（r_M=4.5）。要上就上 r_M ≤ 2 的化学——物理连锁型（CODEC 的四联体接头、ppmSeq 的同 bead 双链、链条码型 CompDuplex-seq/VISTA-seq）。理由见表 4-2B：r_M 从 4.5 降到 2，交叉点从 1,032 掉到 59，等于把 duplex 的适用位点数下探了 17 倍。

同时要清楚各自的硬限制：ppmSeq 因依赖氢键把两链带入同一乳滴，不兼容杂交捕获，只能做 WGS；NanoSeq 的瓶颈化（稀释最多 10,000 倍）是用分子总数换 reads 效率，对 LoD 是净负；CODEC 在 cfDNA 上的 on-target 只有 28.8%（一轮）/71.2%（两轮），显著低于常规 duplex 的 89.0%/99.2%。

八、证据强度：哪些是实测、哪些是我推的、哪些没查到

8.1 实测（同行评议，已核实到原文）

8.2 本报告的推导（未在任何检索到的文献中以此形式出现，使用前请独立复核）

1. 统一 LoD 公式 LoD = [k + z√(Mε)]/M，以及两区制的极限形式。
2. 交叉点解析解 M* = k²/(z²ε) 与 √N* = 3(a−b)/{2.33[b√(aε_s) − a√(bε_d)]}。
3. duplex 净收益判据 √(r_ε/r_M)，以及"交叉存在的必要条件 r_ε > r_M"。
4. 表 4-1 与 4-2 的全部数值（基于 C=0.60、f_SSCS=0.90、f_DCS=0.20、k=3、z=2.33、303 GE/ng 的假设）。
5. "N ≤ 20 时 duplex 恶化 2.5–2.8 倍"这一结论。
6. ssDNA 建库与 duplex consensus 互斥（第一节）——机制推断，本轮未做专门文献核查。

参数敏感性提示：k 从 3 改到 2 或 5、z 从 2.33 改到 1.64（P<0.05），交叉点会移动 2–3 倍，但区制的定性划分和"N≤50 时 duplex 净亏"的结论不变，因为那由 r_M 单独决定。GE 常数 303 与 330 之间还有 9% 的不一致（不同论文取值不同）。

8.3 被核查推翻、已在本文更正的流行数字

8.4 没查到 / 没能核实（诚实披露）

1. 【最大缺口】没有任何一项在同一批临床 MRD 血浆样本上、以 MRD 阳性检出率或复发预测为终点，直接比较 duplex 与 simplex 的研究。全部 6 项头对头证据都停留在体外稀释系列与错误率代理指标。duplex 的临床增益从未被同批直接证明过。这本身应作为结论向决策层陈述。
2. 【第二大缺口】没有任何正式的 duplex vs simplex 成本-效果学论文。可用的只有 CODEC 的"87 倍"（分母未定义、对照组被放宽阈值）、ppmSeq 的"需 100 倍超测序"、以及一份 Revvity 厂商博客声称的"duplex 成本 +2–4 倍"（该页返回 HTTP 403，未能核对原文）。
3. INVAR（Sci Transl Med 2020）全文三条获取路径全部失败（science.org 403、bioRxiv Cloudflare 限流、Europe PMC 无 OA 版本）。"IR = hGA × loci"与"LOD = 1/IR"这一整条标度理论主干，本轮未能直接核实，本文仅将其作为与 Chabon 2020 二项式定义相互印证的旁证使用，模型本身不依赖它。
4. Kurtz 2021 的 3.3×10⁻⁵ / 1.2×10⁻⁵ 的分母正文未写明。这是本报告最重要的一处"未定义"——它直接决定了 r_ε=2.75 这个核心数字能否与 per-base 的错误率并列。需查 Fig 4b 轴标或 Supplementary Methods。
5. SEQC2 的 ctDNA 多平台横评数据未取到——那可能是唯一能提供"同批参考品、多平台、含 duplex 与非 duplex"对照的公开资源。
6. SMaHT Network 2025-12 的六种 duplex 方法同批横评预印本被 Cloudflare 限流，具体 recovery/error/cost 数值未取到（该文不含 cfDNA，也不含 simplex 对照）。
7. SinoDuplex（国内唯一公开的 cfDNA duplex 方法）未报告任何 DCS vs SSCS 同库错误率对照，也未报告分母化的 duplex 回收率。中国本土 duplex 实施的真实回收率数据完全缺失。
8. 世和术宁 Ultra 的"稳定达 0.01%"未标明单位口径（丰度/VAF/tumor fraction），未公开 cfDNA 投入量、是否 duplex、ATG-seq 三重降噪的具体机制。燃石朗微、泛生子洞微无任何公开技术参数。
9. cfDNA 场景下几乎所有方法（PhasED-Seq、INVAR、GeneBits、SinoDuplex、ppmSeq-cfDNA 模式）都未使用 UDG/Fpg 损伤修复，因此其错误率数字均包含未修复的氧化与脱氨损伤成分。跨研究比较错误率时这是一个未对齐的变量。

8.5 全文口径纪律

• VAF vs tumor fraction：本文所有 LoD 数字均为 VAF 口径（突变分子 ÷ 覆盖该位点的总分子）。对一个杂合克隆 SNV，TF = 2 × VAF。Signatera（0.01% VAF ≡ 10,000 拷贝中 1 个突变拷贝）与 NeXT Personal（ppm = 含肿瘤变异共识分子 ÷ 覆盖靶点共识分子总数）都是 VAF 类量；只有 MRDetect / MRD-EDGE 的 TF 更接近真正的肿瘤分子占比。看到任何 ppm，第一句话必须问："分子是突变分子还是肿瘤分子？分母是覆盖分子还是总 cfDNA？"
• 样本级 vs 位点级 LoD：同一批数据可差 10 倍（吉因加：样本级 0.005% vs 位点级 0.05%；Natera：0.01% 处位点级 30%、样本级 85–97%）。厂商报的永远是样本级。
• ppm 必须绑定投入量：Foresight 的 0.7 ppm 其实质是"3.11 个突变分子"，只在特定输入下成立。LoD 随投入线性漂移。

一句话回答

用时约 4 分钟 | 本轮约 68,000 tokens（含调研与核查上下文）